Ekstraksiyon ve SDS-PAGE’deki örneklerin analizi nasıl yapılır?

DENEYİN KONUSU : Protein Estraksiyonu ve SDS-PAGE’deki protein örneklerinin analizi

    MATERYALLER :

        1 – mikropipet ve pipet uçları                                        

        2 – Santrifüj ve tüpler                                            

        3 – Elektroforez tankı ve güç kaynağı                                 

        4 – Erlen, beher        

        5 – Buz ve buz kabı                                         

        6 – Elektroforez tamponu(0.025 M Tris, 0.192 M glisin, 0.0035 M SDS, pH 8.5                        

        7 – Yükleme tamponu (0.4 M Tris, 0.4 M DDT, %8 SDS, %40 gliserol, %0.04 bromfenol mavisi, pH 6.8)

        8 – Coomassie Blue G-250 boyası

        9 – Boyama kabı

        10 – Hamilton şırınga

 

    DENEYİN YAPILIŞI :

        1 – Öncelikle aşağıda verildiği gibi yükleme ve ayırma olmak üzere iki farklı jel karışımı hazırlıyoruz(AMPS[amonyum persülfat] ve TEMED’i jel karışımını kasete dökmeden hemen önce ilave ediyoruz)

	Stok	Yükleme jeli (%5)	Ayırma jeli (%12)
Acrylamid	%30	0.5 ml	4.00 ml
Distile su		2.10 ml	3.3 ml
Tris HCl	1.0M , pH 6.8	0.38	-
Tris HCl	1.5 M , pH 8.8	-	2.50 ml
SDS	%10	30 μl	100 μl
*AMPS	%10	30 μl	100 μl
*TEMED		3 μl	4 μl
Toplam		3.061 μl	10.004 μl

.

        2 – Elekroforez aletinin jel dökme aparatında, jel kaseti içerisine, ilk önce beher içerisinde hazırlanan ayırma jelini döküyoruz(bu işleme başlamadan tankın su sızdırmazlığını bir miktar distile su ile ölçmekte yarar vardır çünkü sıvı olan jel eğer bir sızıntı var ise akıp gidecektir). Hemen sonra ayırma jelinin üzerine polimerleşmeyi (pütürlü yapı olmasını engellemek için yani oksijen ile bağlantısını kesmiş oluyoruz) sağlamak amacıyla distile su yada alternatif olarak n-butenol(biz su kullanacağız çünkü daha pratik) ekliyoruz ve jelin donması için 10-15 dakika 37 ˚C’de etüvde bekletiyoruz.

        3 – Kurumuş olan ayırma jeli üzerine yükleme jelini de ekleyerek yine donmasını bekliyoruz fakat donma işlemine başlamadan önce yükleme yapılabilecek kuyucuklar oluşturmak amacıyla tarak koyuyoruz ve 10-15 dakika donması için bekliyoruz.

        4 – Jel katılaştıktan sonra tarağı çıkarıyoruz elekroforez tankının içine yerleştirerek içerisini elektroforez tamponu ekliyoruz. Ve toplamda 20 μl olan karışımı hazırlayıp, karıştırdıktan sonra 100˚Cde 2 dakika denatürasyon için kaynatıyoruz. Sonraki işlemde ise özel bir enjektör(Hamilton şırınga) yardımıyla her grup iki yükleme yapıyor. Son olarakta marker ‘da eklenerek jelde yürütme işlemine geçiyoruz(aşağıda ise grupların kuyucuklara ne kadar ve hangi maddeleri yüklemeleri gereken tablo buluyor).

Protein örneğimiz	5 μl	10 μl
Yükleme tamponu	5 μl	5 μl
Distile su	10 μl	5 μl
toplam	20 μl	20 μl

 

        5 – Elektroforez tankı içerisindeki jel üzerine sırasıyla 4.grup, 3.grup ,2.grup, 1.grup, marker, 1.grup, 2.grup, 3.grup, 4.grup olarak yükleme yapıldı, buradaki amaç jelin boyama ve yıkama esnasında ters dönmesi halinde kimin nereye yükleme yaptığını karıştırmamaktır.

        6 – Yürütme işlemi içinde güç kaynağını 100 V’a ayarlayarak proteinleri bir saat yürütüyoruz ve bir saatin sonunda da 120 V’a çıkararak işlemi hızlandırıyoruz. Proteinler ayırma jelinin son noktasına geldiğinde de gücü kesip jeli çıkarak boyama işlemine geçiyoruz.

        7 – Jeli boyama işlemi için Coomassie Blue kimyasalını yarım saat jele uyguladıktan sonra fazla boyanın çıkması ve protein bantlarının görülebilir hale gelmesi için çözelti A’da yıkama işlemi yapılır.

NOT: Ayırma jeli, yürütme jeli ve çözelti A’da yıkama işlemleri hocalarımız tarafından gerçekleştirildi.

 

2.grup uzunlukları(y)

3.5 mm

5 mm

7 mm

8.5 mm

10 mm

12 mm

14 mm

17 mm

18 mm

19 mm

20 mm

22 mm

24 mm

27 mm

28 mm

30 mm

    GÖZLEM ve SONUÇLAR :

      Gözlem: Hazırlamış olduğumuz protein örneği, yükleme tamponu ve distile su karışımının jelde elektrik etkisiyle hareketi gözlendi. Ve elimizde şöyle bir tablo oluştu(molekül ağırlığı hesaplamak adına bir marker’dan birde kendi örneğimizden aldığımız bantlaşmaları gösteren).

Proteinler	Molekül ağırlığı	Uzunluk
1.bant: miyozin	205	3 mm
2.bant: β-Galaktozidaz	116	6 mm
3.bant: Fosforilaz b	97	8 mm
4.bant: Fruktoz 6 fosfat kinaz	84	10 mm
5.bant: Bovine serum albumin	66	12 mm
6.bant: Glutamik dehidregenaz	55	15 mm
7.bant: Ovalbumin	45	18 mm
8.bant: Gliserol 3 fosfat dehidrajenaz	36	22 mm
9.bant: Tripsinojen	24	29 mm
10.bant: Tripsin-inhibatör	20	31 mm
11.bant: α-Laktol bumin	14	38 mm

 

      Toplam uzunluk ise x=46mm olarak bulundu buna göre hesaplama yapabilmek için şu formülü kullanmak gerekiyor:  [ y/x ] bütün uzunluk değerlerini bu formüle göre buluyoruz ve grafik haline getiriyoruz.

 1.değer: 3.5 / 46 = 0.076         2.değer: 5 / 46 = 0.108           3.değer: 7 / 46 = 0.152

 4.değer: 8.5 / 46 = 0.184         5.değer: 10 / 46 = 0.217         6.değer: 12 / 46 = 0.260

 7.değer: 14 / 46 = 0.304          8.değer: 17 / 46 = 0.369         9.değer: 18 / 46 = 0.391

 10.değer: 19 / 46 = 0.413       11.değer:20 / 46 = 0434         12.değer: 22 / 46 = 0.478

 13.değer.24 / 46 = 0.521        14.değer: 27 / 46 = 0.586       15.değer: 28 / 46 = 0.608

 16.değer: 30 / 46= 0.652mm

        *Grafik ek de bulunmaktadır.

      Sonuç: Deneyden sonuç çıkarabilmek için öncelikle kullandığımız kimyasalların işlevlerini vermek daha iyi olacaktır.

   Kimyasal işlevleri:

 *AMPS:Polarizasyonu sağlamak.

*TEMED: Reaksiyonu katalizlemek.

*Tris HCl: İyonik denge sağlayıcı

*Bisakrilamid: Reaksiyonu başlatıcı.

*SDS: Proteinlerin denatürasyonu ve pozitif yükle sağlanmasını sağlayıcı.

     Buna göre proteinlerin bir jelde yürütülmesi ve buna bağlı olarak geçirdiği işlemlerin bazı kimyasallara bağlı olduğunu söyleyebiliriz. Şöyle ki proteinler başlangıçta çok kompleks yapıda olduklarından öncelikle onların inceleme yapılabilecek duruma getirilmesi(daha önceki deneylerimizde yapmıştık[protein saflaştırılması] ), proteinlerin hem pozitif hemde negatif yüklere sahip olduğundan ötürü SDS in eklenerek bütün proteinlerin negatif yüklenmesi sağlanarak ve jelin por açıklıkları vasıtasıyla pozitif kısıma yürümesi sağlanır. Yalnız bu yürüme işleminin sağlanması için bir başlatma ajanı (bisakrilamid), işlemin daha hızlı ilerlemesi için (TEMED) belli başlı kimyasallar kullanılarak işlemi sonlandırmak gerekir yani buradan çıkartılan sonuç proteinlerin her iki yükü birden taşımları, por açıklıklarının boyutları,  kullanılan marker’ın çeşidi, proteinlerin jel üzerinde yürümesini sağlayan etmenler olmaksızın proteinlerin molekül ağırlıklarını hesaplamak imkansızlaşır.

grafiğe ulaşamıyorum nerede acaba ?

Tablo net bir şekilde konu içerisinde yer alıyor?