Jump to content
MehmetEmin

CRISPR Cas9 DNA DÜZENLEME YÖNTEMİNE GENEL BAKIŞ

Önerilen İletiler

Önsöz

Bu sayfadaki ilk yayınım olması dolayısıyla gayet heyecanlı olduğumu belirtmek isterim. Bu yazının temel amacını belirtmek gerekirse, biyoloji ile ilgilenen ancak uzmanlığı olmayan kişiler, bu dal ile yakından ilgilenen ve teknik donanımı yerinde olan kişiler ve ilgi alakası olan herkes için oldukça basit anlaşılır ve yalın bir dille CRISPR-Cas9 sistemini özetleyeceğim. Yararlı olması dileğiyle...

SON YILLARIN GÖZDESİ CRISPR Cas9 YÖNTEMİNE GENEL BAKIŞ

Bir çoğumuzun popüler dergiler, sosyal medya ve çevremizden duyduğu bu yöntem, bugüne kadar biyoloji ve moleküler biyoloji alanlarında PCR teknolojisinden sonra gerçekleştirilmiş en önemli çalışmalardan biridir. Kısaca tarihi gelişimine bir bakalım;

                                 CRISPR "Clustered Regularly Interspaced Short Palindomic Repeat" (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar) dizileri ilk olarak 1987'de E.Coli'nin genomunda keşfedilmiştir. Fakat onların bakteriyofajlara karşı bir koruyucu işlevine 2007'ye kadar açıklık getirilmedi. İlk deneyler, yoğurt ve peynir üretimi için önemli bir bakteri olan S. thermophilus'u, eksojen faj DNA'sının bakteri genomuna CRISPR tekrarlarının bir parçası olarak dâhil edilebileceğini test etmek için yırtıcı fajlara maruz bırakıldı. Polimeraz, nükleaz ve helikazı kodlayan Cas (CRISPR ilişkili) genler bu süreçteki çeşitli rollerini belirlemek için bozuldu. Bilim adamları prokaryotların bir uyarlayıcı bağışıklık sistemi geliştirdiği hipotezini kurdu, bu durum çeşitli Cas genlerini kullanarak sadece istila eden fajların kaydını tutmakla kalmaz aynı zamanda tekrar maruz bırakıldığında fajın yok edilmesini sağlar. Daha belirli bir biçimde, özelleşmiş Cas proteinleri, yabancı DNA'yı yaklaşık 30 bp uzunluğunda küçük parçalara sokar ve bunları CRISPR dizisine yapıştırır (Bu kısma ileride şekiller ile açıklık getireceğim). Bugün hızla ilerleyen CRISPR çalışmalarında çeşitli tipler doğmuştur bunlardan en yaygın ve bilineni Tip II dir. Tip II CRISPR / Cas sisteminden sonra en son  2015 yılında V. tipi keşfedilmiştir.  (CRISPR Gen Modifikasyonları T101)

CRISPR VE MEDYA

Bugün bir çok yerde karşılaştığımız haberlere değinmek'de istiyorum. CRISPR'ın başarıları gün geçtikçe arttığının bariz kanıtları olarak gösterebileceğimiz bir çok bilimsel haber değer taşıyan haberleri bulmak mümkün. CRISPR yönetemi ile geliştirilen ve en yaygın olarak bilinen tedavi yöntemi CAR-T hücre tedavisi ( başka yazılarımda değineceğim) uzun zamandır araştırmacılar bu yöntemi kullanarak büyük başarılara imza attılar. Özellikle kendilerine zor hedefler seçtiler örneğin ''Akut Lenfoblastik Lösemi'' (ALL) hastalarının kritik dönemde olan bireyleri üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bunlardan en dikkat çekeni; Dr. Grupp, tekrarlayan veya mevcut tedavilere cevap vermeyen TÜM‘li çocuklarda ve genç yetişkinlerde CAR T hücrelerinin çeşitli denemelerini gerçekleştirmiştir. CD19 hedefli CAR T hücrelerini kullanılan  daha önceki denemelerden birinde, çalışmada tedavi edilen 30 hastanın 27’sinde tüm kanser bulguları kayboldu (tam bir yanıt verdi) ve bu hastaların birçoğunun tedaviden sonra tekrarlama belirtileri göstermediğide rapor edilmiştir. Ayrıca son dönemlerde nadir hastalıklar ve parkinson, alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklarla alakalı çalışmalarada hız verilmiştir. Ülkemizde'de Dr. Cihan Taştan ve aralarında benimde bulunduğum 3 arkaşımında bulunduğu CRISPR-Cas9 yöntemi ve Nadir hastalıklar konulu Türkçe bir derlemeninde yolda olduğunu buradan müjdelemek isterim. 

 

 

 

 

CRISPR-Cas9 DNA EDİTİNG 

Bu kısma giriş yapmadan önce yazımızın içerisinde kullanacağımız teknik terimler için küçük bir sözlük hazırlamak istiyorum.

Cas (CRISPR Associated Protein):  CRISPR Bağımlı Protein, Cas9 nükleazı Tip II CRISPR sistemindeki aktif bir enzimdir.

gRNA:   Rehber DNA, sentetik olarak endojen bakteriyel tracrRNA ve crRNA’nın birleştirilmiş formu; Hem Cas9 nükleazın iskele kurup/bağlanmasını hem de istenen DNA’nın hedeflenme spesifitesini sağlar; Doğal olarak bulunmaz; Tek rehber DNA (single guide RNA) ya da ‘sgRNA’ olarak da isimlendirilir.

PAM (Protospacer Adjacent Motif):  Cas9’un hedef DNA’ya bağlanması için gerekli; Hedef diziden hemen sonra olmak zorunda.

sgRNA:  Rehber DNA; Sentetik olarak, endojen bakteriyel tracrRNA ve crRNA’dan elde edilen hedefleme ve iskele dizisinin birleştirilmiş formu; Genom mühendisliği
çalışmalarında, Cas9’un spesifik genomik lokusu hedeflemesinde kullanılır; ‘gRNA’ olarak da isimlendirilir.

 

crispr-cas9-genome-editing.png.00e021caf32c879499f5f656ce3e1bf6.png

Şekil 1: Cas9, crRNA, PAM, tracrRNA, gRNA, genomik DNA, hedef dizi  (Anonim)

Gerekli bilgileri sağladıktan sonra asıl konumuza geçelim. CRISPR-Cas9 sisteminin Tip II çalışmalarının temel prensibini görseller ile anlatacağız. Bakteriler son derece olumsuz koşullara adapte olabilmiş ve bulundukları habitat içeresinde egemenliğini sürdürebilmiştir. Bakteriler bu egemenliklerini bazı adaptasyonlara borçludurlar; reseptör mutasyonu, restriksiyon modifikasyonu gibi çok sayıda doğal bağışıklık benzeri sistemlerinin yanında, son olarak spesifik ve dış kaynaklı genetik elementlere karşı kazanılmış bağışıklığı sağlayan CRISPR-Cas adaptif immün sistemi tanımlanmıştır. Bakteriler üzerinde yapılan bu çalışmalar in vitro koşullarda CRİSPR yönteminin kabulü için ön ayak olmuştur (2007).  CRISPR’ın görev tanımını yapacak olursak en kaba şekilde şöyle diyebiliriz; DNA dizisi üzerinde belli polindromik baz çiftlerinin kesilip-çıkartılıp yerlerine istenilen bazlar yerleştirilerek DNA üzerinde istekli şekilde değişiklikler yapılması. Bu açıklama sistemin basitliğini anlamak açısından önemlidir. 

                                         Yapılan çalışmalarda, CRISPR Tip II sistemi için gerekli olan en az üç bileşen olduğu bildirilmiştir (Cas9, matür crRNA, tracrRNA). CRISPR aktivitesi için genellikle CRISPR dizilerine bitişik bulunan ve immün yanıt için proteinleri kodlayan CRISPR ilişkili (Cas) genlerin varlığına ihtiyaç vardır.  Bu karakteristik CRISPR dizileri yabancı genetik materyalin kısa segmentlerinden türevlenen tekrarlanmayan sekansların tekrarlayan sekanslar içerisine girmesi ile oluşur. Yani bakteriyi enfekte eden virüs DNA’sının belirli kısımları tekrar genleriyle birlikte CRISPR bölgesine yerleştirilir.

5ad22050a3d29_EkranAlnts.PNG.805ac95035034ec8f92bdc94867dbbb3.PNG

 Şekil 2: Bakteriyel kromozomda bir CRISPR bölgesinin yapısı (Anonim, 2016)

 

 

 

 

 

 

 

CRISPR-Cas bağışıklık sistemi hücre içerisinde immüniteyi üç adımda gerçekleştirir ;

 

5ad220466ec2f_EkranAlnts2.PNG.c9771f218ae72120269f958b80d81e70.PNG

Şekil 3: Tip II CRISPR (CRISPR Gen Modifikasyonları T101)

 

1.ADIM

  •   İlk adım, ekzojen (virüs) nükleik asitten elde edilen aralık kısımların CRISPR bölgesine yerleştirildiği adaptasyondur.
  •   Bu adımda, protoaralıkların seçimi, istilacı plazmid ve faj genomlarında bulunan protoaralık bitişik motiflerin (protospacer adjacent motif- PAM) spesifik tanınması ile belirlenir.
  •  PAM’lar 2-5 nükleotitten oluşan, yüksek korunmuş dizi motifleridir.
  •  PAM sekansına sahip yabancı DNA aralık kısmı, tekrarlayan genlerle birlikte CRISPR bölgesine yerleştirilir.
  •  Bakteriyel CRISPR bölgesindeki tekrarlar içindeki PAM tanıma dizilerinin eksikliği CRISPR-Cas sistemlerinin kendini hedefleme ve kendini kesme olasılığını ortadan kaldırırken PAM dizilerindeki mutasyonlar fajın CRISPR bağışıklığından kaçmasına izin vermektedir.

Bu adımların daha iyi anlaşılabilmesi için aynı zamanda birde küçük bir benzetme yapacağım; Bu şemadaki atmosferi bir Amerikan kasabasına benzetelim. Bu kasabanın suçluları ve birde polisleri olsun. Suçluların amacı kasabaya girip illegal işler gerçekleştirmek. Burada suçlular fajın DNA’sı ve polisler ise Cas enzimleridir. Kasabaya giren suçluların bir kısmını 1.aşamada bu polisler yakalıyor ve diğer suçlularında eşkallerini merkeze ( Cas gen dizileri ) bildiriyorlar.

2. ADIM

  •   İkinci adımda, istilacı DNA’daki hedef sekansın CRISPR lokusuna sokulduğu bölge, öncül CRISPR RNA’lara (pre-crRNA) transkribe edilir ve oluşan pre-crRNA transkriptleri Cas endoribonükleazlar tarafından ekzojen DNA hedef sekanslarıyla Watson-Crick baz eşleşmesi gösteren küçük crRNA’lara dönüştürülür (crRNA’nın sekansı istilacı DNA’nın sekansına karşılık gelir)
  • Bu aşamada faj DNA sı ve CRISPR sekansı birleşerek transkripsiyon geçirip yeni bir dizi oluştururlar.

2.adımda kasabada işler kontrole alınmaya başlıyor (Cas II) ve kasabanın her yerine suçluların fotoğrafları ve suçlarını belirten kağıtlar dağıtılıyor (işlenmiş crRNA).

 

3. ADIM

  •   Son adım ise hedefleme olup, bu adımda, crRNA ile Watson-Crick baz eşleşmesinden yararlanılarak istilacı nükleik asitler hedeflenir, Cas nükleazlar ile homolog sekanslar kesilerek virüslerin ve plazmidlerin çoğalması önlenir.

3. adımda kasabanın muhafızları (Cas III) ortamdaki suçluları yakalamak için harekete geçerler ve ortam suçlulardan arındırılır.

 

Son olarak diğer yazılarımda CAR-T hücre tedavisi, Nadir hastalıkların tedavisinde CRISPR, CRISPR ve endişeleri gibi konulara değineceğim. 

Kaynak olarak içerisinde çevirmen olarak yer aldığım ve internetten kolayca ulaşıp e-book şeklinde indirebileceğiniz  ''CRISPR Gen Modifikasyonları T101''  kitabını eğer meraklı iseniz mutlaka okumanızı tavsiye ediyorum. İyi günler dilerim.

 

 

 

İletiyi paylaş


İletiye bağlantı

Yorum yazmak için hesap oluşturmalı veya giriş yapmalısın.

Yorum yapmak için üye olmanız gerekiyor

Hesap oluştur

Hesap oluşturmak ve bize katılmak çok kolay.

Hesap Oluştur

Giriş yap

Zaten bir hesabınız var mı? Buradan giriş yapın.

Giriş Yap

Hakkımızda

Biyoloji Günlüğü ülkemizdeki biyoloji öğrencileri, mezunları ve çalışanları adına kar gütmeyen bir proje olarak 9 senedir faaliyetlerine yılmadan devam etmeye çalışan masum bir projedir. Lütfen art niyetinizi forumdan uzak tutunuz. Bize iletişim formu aracılığıyla ulaşabilirsiniz.

Dilerseniz biyolojigunlugu@gmail.com veya admin@biyolojigunlugu.com adresine mail de gönderebilirsiniz. Bizimle arşivinizi paylaşmak isterseniz wetransfer.com üzerinden biyolojigunlugu.com adresine dosya transferi olarak iletmeniz yeterlidir, sizin adınıza paylaşılacaktır.

Sitemiz bir "Günlük" olarak derleme yayın, yorum, diyalog ve yazılara vermektedir. Güncel biyoloji haberleri ve gelişmelere ek olarak özellikle sosyal medyada gözden kaçan, değerli gördüğümüz tüm içeriğe kaynak ve atıflar dahilinde sitemizde yer vermekteyiz. Bu sitede verilen bilgilerin kullanım sorumluluğu tümüyle kullanıcıya aittir. Sayfalarımızda yer alan her türlü bilgi, görsel ve doküman sadece bilgilendirmek amacıyla verilmiştir.

Biyoloji Günlüğü internet sitesi 5651 Sayılı Kanun’un 2. maddesinin 1. fıkrasının m) bendi ile aynı kanunun 5. maddesi kapsamında Yer Sağlayıcı olarak faaliyet göstermektedir. İçerikler, ön onay olmaksızın tamamen kullanıcılar tarafından oluşturulmaktadır. Yer Sağlayıcı olarak, kullanıcılar tarafından oluşturulan içeriği ya da hukuka aykırı paylaşımı kontrol etmekle ya da araştırmakla yükümlü değildir.

Yer Sağladığı içeriğin 5651 Sayılı Kanun’un 8 ila 9. maddelerine aykırı şekilde; kişilik haklarınızı ihlal ettiğini ya da hukuka aykırı olduğunu düşünüyorsanız mail adreslerimizden iletişime geçerek bildirebilirsiniz. 

Bildirimleriniz dikkatle ve özenle incelenmekte olup kişilik haklarınızın ihlali ya da hukuka aykırılığın tespiti halinde mevzuat kapsamında en kısa sürede işlem yaparak bilgi vereceğiz.

×
×
  • Yeni Oluştur...

Önemli Bilgilendirme

Kullanım Şartları, Gizlilik Politikası, Forum Kuralları sayfalarına göz atınız.