Proteaz ve DNaz ile etkileşimleri agaroz jelde nasıl incelenir?

DENEYİN KONUSU:  DNA ve Proteinlerin Enzimlerle İlişkileri

 DENEYİN AMACI: DNA ve proteinlerin proteaz ve DNaz ile etkileşimlerinin agaroz jel ile incelenmesi.

       MATERYALLER :

           1 – Agoroz

           2 – Tris-asetat(TAE) tamponu (Agaroz jel elekroforezi için)

           3 – Yükleme tamponu (DNA için)

          4 – Standart DNA (marker)

          5 – Etidyum bromür

          6 – Mezür

          7 – Mikrosantrifüj tüpleri

          8 – Mikropipet ( 0.5-10 μl , 10-100 μl )

          9 – Elekroforez cihazı

          10 – Mikrodalga fırın

          11 – Proteaz K

          12 – Dnaz I

 DENEYİN YAPILIŞI :

          1-) Deneye başlamadan önce hazırlayacağımız jel tablasının kuru ve temiz olmasına dikkat ediyoruz (çünkü daha önceden bu tabla üzerinde etüdyum bromür kullanılmış olabilir ve bu yüksek derecede kansorejen bir kimyasaldır).

          2-)50 ml TAE ve 450 ml distile suyu karıştırarak 1x’lik 500ml TAE hazırlıyoruz(bunu hem agaroz jeli hazırlarken hemde yürütme işlemi yaparken tampon olarak kullanacağız)

          2-)0.24 gram Agoroz tartılarak işleme başlanır ve mezürde 30 ml TAE tamponu eklenerek mikrodalga fırında bu karışımı çözdürürüz.

          3-) Elde ettiğimi karışım elle tutulabilecek sıcaklığa eriştiğinde (50-55 ˚C) çeker ocak altında 2 μl etidyum bromür ilave ederiz (bu işlemde solüsyonda hava kabarcığı kalmamasına dikkat ediyoruz).

          4-) Bu işlem sonrasında hazırlamış olduğumuz solüsyonu kenarları kapatılmış jel tablasına dökeriz ( dökme işlemi yapılırken sızıntı olmamasına dikkat edilerek bu işlem yapılmalıdır).

          5-) Jel döküldükten sonra üzerinde DNA  bromfenol blue karışımı ve markerımızı  ekleyecek olduğumuz kuyucukların oluşması için jel üzerine tarağı yerleştiriz.

          6-) Jel donduktan sonra tarağı dikkatlice( jele doğrudan dokunmadan hatta bir eldiven vasıtasıyla, [doğrudan etüdyum bromür temasından kaçınmak için]) çıkararak jeli elekroforez tankına yerleştiririz. Ve tankın üzerindeki sınır çizgisine kadar TAE tamponu dökeriz.

          7-) Bir önceki deneyde izole ettiğimiz ve TE tamponu ile çözmüş olduğumuz DNA örneği ile loading buffer’ı karıştırız ve jelde tarak uçları ile oluşturmuş olduğumuz kuyucuklara boşaltırız.( Bu deneyde maker harici hazırlayacağımız DNA örneği miktarları aşağıda bulunmakta)

                     a) 2 μl DNA örneği  + 5 μl Proteaz + 3 μl distile su + bromfenol mavisi (1.ve 2. gruplar) (1. grup 3 DNA örneği, 2. grup olarak 2 tane DNA içeren örnek hazırladık[fakat el alışkanlığı içinde distile su ve bromfenol mavisi karıştırarak yükleme yapıldı)

                     b) 2 μl DNA örneği + 4 μl DNaz + 4 μl distile su + bromfenol mavisi (3. ve 4. gruplar)

          8-) Aktarma işleminden sonra cm’ye 6 V olacak şekilde akım veririz (60 V).

          9-) 30 dakika sonra DNA’nın  yürümesi işleminden sonra jeli dikkatlice (etüdyum bromür ilavesinden dolayı) alarak transüliminatör üzerine alarak UV ışığı altında fragmentlerinin analizini yapabilecek duruma geliriz.

       GÖZLEM VE SONUÇLAR :

          Bütün deneyi 1.ve 2. grup olarak agaroz jeli oluşturma aşaması da dahil olmak üzere(bu kısım daha önceki DNA analizi deneyinde hocalarımız tarafından yapılmıştı) bütün deney aşamalarını gerçekleştirdikten sonra UV ışığı altında proteaz’ın DNA üzerinde hiçbir etkisinin olmadığını gördük bunun yanında 3.ve 4. grupların DNA’ya DNaz etkisini ise ortamda hiçbir DNA fragmetinin kalmadığını görmüş olduk.

       YORUM :

          Eğer ki elimizde analizini yapacağımız bir DNA, RNA yada protein varda ve bunların tam olarak saf olmadığını düşündüğümüz zamanlarda değişik kimyasal madde içerikleriyle bunları saflaştırmak mümkün hale gelir. Örneğin bir DNA analizi sırasında ortamda protein varlığı söz konusuysa burada Proteaz kullanarak bunu ortamdan atmak ve DNA mızı saflaştırmak olası hale gelir(her ne kadar RNA uzaklaştırma deneyi yapmasak da DNA ve proteinlerin ortamdan uzaklaştırılabildiğini görünce RNA içinde bir yöntem olacağını düşünüyorum). Bu yolla sadece üzerinde çalışmak isteğimiz grupları oluşturmak ve o gruplardan istediğimiz verileri almak daha kolaylaşacaktır. Şöyleki analiz süresince (özellikle elekroforez sırasında) elimizdeki örnekte sadece istediğimiz materyal haricinde farklı bir materyal bulunması ve bunun varlığında elektroforez süresinin de etkileneceğini düşünüyorum. Yani yürütme işlemi sırasında ortamda bulunan fazla maddelerden kaynaklı(proteinleri incelerken DNA varlığı gibi olaylardan bahsediyorum) süre uzaması olayının jel açıklarından geçen maddelerin fazlalığından kaynaklı olabileceği ihtimali göz önüne geliyor. İşte bu sebeplerden dolayı incelemek istediğimiz grupların bazı kimyasallar yardımı ile sadece DNA ,RNA yada protein inceleyebilmek mümkün hale gelmektedir demek mümkün hale gelmektedir..