DNA Agoroz Jel Elekroforezi nasıl yapılır?

DENEYİN KONUSU : DNA Agoroz Jel Elekroforezi

       MATERYALLER :

           1 – Agoroz

           2 – Tris-asetat(TAE) tamponu (Trisma base, Glasiyal asetik asit, EDTA pH 8.0)

           3 – Loading Tampon ( 4 M Üre, 0.025 M EDTA, %60 sukroz, 0.025M Bromphenol blue, 0.025 M Ksilen)

          4 – Standart DNA (marker)

          5 – Etidyum bromür

          6 – Mezür

          7 – Mikrosantrifüj tüpleri

          8 – Mikropipet ( 0.5-10 μl , 10-100 μl )

          9 – Elekroforez cihazı

          10 – Mikrodalga fırın

 DENEYİN YAPILIŞI :

          1-) Deneye başlamadan önce hazırlayacağımız jel tablasının kuru ve temiz olmasına dikkat ediyoruz (çünkü daha önceden bu tabla üzerinde etüdyum bromür kullanılmış olabilir ve bu yüksek derecede kansorejen bir kimyasaldır).

          2-) Sonrasında 0.24 gram Agoroz tartılarak işleme başlanır ve mezürde 30 ml TAE tamponu eklenerek mikrodalga fırında bu karışımı çözdürürüz.

          3-) Elde ettiğimi karışım elle tutulabilecek sıcaklığa eriştiğinde (50-55 ˚C) çeker ocak altında 2 μl etidyum bromür ilave ederiz (bu işlemde solüsyonda hava kabarcığı kalmamasına dikkat ediyoruz).

          4-) Bu işlem sonrasında hazırlamış olduğumuz solüsyonu kenarları kapatılmış jel tablasına dökeriz ( dökme işlemi yapılırken sızıntı olmamasına dikkat edilerek bu işlem yapılmalıdır).

          5-) Jel döküldükten sonra üzerinde DNA  bromfenol blue karışımı ve markerımızı  ekleyecek olduğumuz kuyucukların oluşması için jel üzerine tarağı yerleştiriz.

          6-) Jel donduktan sonra tarağı dikkatlice( jele doğrudan dokunmadan hatta bir eldiven vasıtasıyla, [doğrudan etüdyum bromür temasından kaçınmak için]) çıkararak jeli elekroforez tankına yerleştiririz. Ve tankın üzerindeki sınır çizgisine kadar TAE tamponu dökeriz.

          7-) Bir önceki deneyde izole ettiğimiz ve TE tamponu ile çözmüş olduğumuz DNA örneği ile loading buffer’ı karıştırız ve jelde tarak uçları ile oluşturmuş olduğumuz kuyucuklara boşaltırız.( Bu deneyde maker harici iki şekilde DNA örneği hazırlayacağız)

                     a) 5 μl DNA örneği  + 1 μl bromfenol blue

                     b) 2 μl DNA örneği  + 3 μl TE tamponu + 1 μl bromfenol blue

                Ve marker içinde şu formülü kullanacağız : 

                     1 μl marker + 1 μl bromfenol blue + 4 μl distile su

          8-) Aktarma işleminden sonra cm’ye 5 V olacak şekilde akım veririz (50 V)

          9-) 45 dakika sonra DNA’nın  yürümesi işleminden sonra jeli dikkatlice (etüdyum bromür ilavesinden dolayı) alarak transüliminatör üzerine alarak UV ışığı altında fragmentlerinin analizini yapabilecek duruma geliriz.

       GÖZLEM VE SONUÇLAR :

          UV ışığı altında fotoğrafını çektiğimiz DNA fragmentlerinin kaç baz çifti içerdiğini tam olarak anlayabilmek için marker’ın ne kadar baz çifti serisinin verilmiş olduğu hazır şablondan yararlanılır. Çünkü elimizde sabit değerleri bulunmayan bir belirleyici (marker) olsaysı DNA’nın ne kadar baz çiftinin olduğunu hesaplamak mümkün olmazdı. Bu yüzden firmadan gönderilen marker’ın hangi aralıklarda ne kadar baz çifti içerdiği dokümana bakılması gerekir.

          Ekte bulunan UV sonucuna göre bizim DNA’mızda 21000’i biraz aşan sayıda baz çifti olduğu anlaşıldı çünkü marker ile kendi DNA örneğimizi karşılaştırıken DNA baz çiftlerinin nerelerde toplandığına ve bunun marker üzerinde hangi aralığa denk geldiği okunarak baz çifti hesaplaması yapılabilir. Buna göre UV transüliminatörü altında marker ve kendi DNA örneğimizi karşılaştırdığımızda 21000’i geçen sayıda baz çifti bulunduğunu görmüş olduk. Yalnız son bantta karalama gibi şekillerin çıkması DNA’mızın tam olarak saf olmadığını gösterir ki bir önceki raporumuzda bu sonuçlara ulaşmıştık..

       YORUM :

          Farklı por açıklıkları içeren jellerden farklı boyutlarda DNA baz çiftlerinin geçebildiği, yalnız bu işlemin gerçekleşmesinin nedenlerinden birisinin DNA fragmentlerinin kesilmesinden kopmasından kaynaklı olarak farklı şekillerde bantlaşmalar gösterebileceğini öğrenmiş olduk, bunun yanı sıra UV ışığı yardımı ile DNA’nın baz çifti sayısını da hesaplayabileceğimizi fakat DNA baz çiftinin belirlenmesinin DNA’nın ne kadar saflıkta olduğu hesaplamada kullanabilecek bir yöntem olmadığını da görmüş olduk.