Protein Konsantrasyonu Nasıl Belirlenir?

[Cenk Önsoy]

DENEYİN KONUSU : Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi  

    MATERYALLER :

        1 – Bovine serum albumin= BSA

        2 – Bradford boyası

        3 – Distile su

        4 – Mikropipetler (10-100 μl , 100-1000 μl)

        5 – Spectrofotometre küveti , ependorf tüpler

        6 – Daha önce hazırladığımız Tampon B ve protein içeren solüsyonlar

    DENEYİN YAPILIŞI :

        1 - Öncelikle spektrofotometreyi sıfırlamak için gerekli olan kör küvetleri hazırlandı(asistanlar tarafından). İki ayrı küvete 500 μl BSA ile 500 μl Bradford koyarak karışmasından oluşturuldu.

        2 – Protein ölçümü için ilk önce konsantrasyonu bilinen bir proteniden (BSA) standart bir eğri hazırlamamız gerekiyor. Bunun için 1 mg/ml BSA’nın farklı konsantrasyonlarına Bradford boyası ekleyerek aşağıdaki tabloyu oluşturuyoruz.

Tüpler		1	2	3	4	5	6	7	8
BSA (μl)		10	20	50	100	150	200	300	400
Distile su (μl)		490	480	450	400	350	300	200	100
Bradford (μl)		500	500	500	500	500	500	500	500
Toplam(μl)		1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000
	Gruplar	1.grup		2.grup*		3.grup		4.grup

        3 – Daha önceki deneyde hazırlamış olduğumuz izole protein örneklerinin her birinden birer tane aşağıdaki miktarlarda ekleyerek absorbsiyon değerlerini öğrenmek için speckrofotometreye göndermeye hazır duruma geleceğiz.

 

Protein örneği	10 μl
Distile su	490 μl
Bradford	500 μl
Toplam	1000 μl

        4 – Örnekleri iyice karıştırdıktan sonra en az 5 dakika bekleyerek, 595 nm’de ki absobsiyon değerini ölçmek için spektrofotometre cihazının bulunduğu yere gidilir.

        5 – Aldığımız sonuçlarına göre doğrusal grafik hazırlama işlemine geçilir. Bu işlemde absise( x eksenine) standart protein çözeltilerinin konsantrasyon değerlerini, ordinatına (y eksenine) da absorbsiyon değerlerini(A.D) değerlerini girerek, standart bir eğri oluşturmaya çalışacağız.

        6 – Bu grafiğin hazırlanma sebebi bizim hazırlamış olduğumuz protein değerinin konsantrasyonunu bulmaktır. Bu işlem içinde hazırladığımız protein örneklerinin A.D değerlerini x eksenine dik olacak şekilde getirerek protein örneğimizin ne kadar miktarda olduğunu öğrenmek içindir.

    GÖZLEM ve SONUÇLAR :

    Gözlem:

Tüpler		1		2	3		4	5		6	7	8
BSA (μl)		10		20	50		100	150		200	300	400
Distile su (μl)		490		480	450		400	350		300	200	100
Bradford (μl)		500		500	500		500	500		500	500	500
Toplam(μl)		1000		1000	1000		1000	1000		1000	1000	1000
	Gruplar	1.grup			2.grup*			3.grup			4.grup
	Absorbsiyon değerleri(595 nm’de)	0.483	0.582		0.960	1.023		1.137	1.178		1.186		X

        İlk 7 tüpte beklenmedik bir rakam ile karşılaşılmaz iken 8. ependorfda A.D değeri okunamamıştır.

Protein örneği	10 μl	10 μl
Distile su	490 μl	490 μl
Bradford	500 μl	500 μl
Toplam	1000 μl	1000 μl
Absorbsiyon değerleri(595 nm)	0.879 (1. ependorf)	0.959 (2.ependorf)

      Yandaki tabloda görülen değerlerin ortalamasını alarak sonuca varacağız. Çünkü 2. grup olarak her iki protein örneğimizin de A:D’ sini almıştık (herhangi bir olumsuz sonuç için), ve aldığımız bu değerlerin birbirine yakın olmasından dolayı bu ikisinin ortalamasını alarak tablo oluşturma işlemine geçeceğiz.

         (1.ependorf A.D + 2. ependorf A.D) / 2 = ortalama A.D

       => (0.879+0.959) / 2 = 0.959 ≈ 0.960 eder.

 

    Sonuç:Farklı protein solusyonlarında ne kadar protein olduğunu hesaplama yöntemlerinden birisinin BSA kimyasalı ile belirlenmiş A.D değerlerin hesaplanıp grafik üzerinde gösterimi ile olabileceğini görmüş olduk. Yalnız grafik oluştururken BSA ile ölçülmüş A.D’ lerin değerlerinin birbirinden çok farklı olmamalarına dikkat edilmeli aksi takdirde A.D’ler grafiğe eklenirken bir eğri yerine bir aşağı bir yukarı giden eğriyi yakalamak mümkün olmaz. O yüzden eğrinin durumunu bozacak değerlerin eğriye eklenmeden hesaplamaları yapılarak grafik tamamlanmış olur