Jump to content

Proteaz ve DNaz ile etkileşimleri agaroz jelde nasıl incelenir?


Önerilen İletiler

DENEYİN KONUSU:  DNA ve Proteinlerin Enzimlerle İlişkileri

 DENEYİN AMACI: DNA ve proteinlerin proteaz ve DNaz ile etkileşimlerinin agaroz jel ile incelenmesi.

       MATERYALLER :

           1 – Agoroz

           2 – Tris-asetat(TAE) tamponu (Agaroz jel elekroforezi için)

           3 – Yükleme tamponu (DNA için)

          4 – Standart DNA (marker)

          5 – Etidyum bromür

          6 – Mezür

          7 – Mikrosantrifüj tüpleri

          8 – Mikropipet ( 0.5-10 μl , 10-100 μl )

          9 – Elekroforez cihazı

          10 – Mikrodalga fırın

          11 – Proteaz K

          12 – Dnaz I

 DENEYİN YAPILIŞI :

          1-) Deneye başlamadan önce hazırlayacağımız jel tablasının kuru ve temiz olmasına dikkat ediyoruz (çünkü daha önceden bu tabla üzerinde etüdyum bromür kullanılmış olabilir ve bu yüksek derecede kansorejen bir kimyasaldır).

          2-)50 ml TAE ve 450 ml distile suyu karıştırarak 1x’lik 500ml TAE hazırlıyoruz(bunu hem agaroz jeli hazırlarken hemde yürütme işlemi yaparken tampon olarak kullanacağız)

          2-)0.24 gram Agoroz tartılarak işleme başlanır ve mezürde 30 ml TAE tamponu eklenerek mikrodalga fırında bu karışımı çözdürürüz.

          3-) Elde ettiğimi karışım elle tutulabilecek sıcaklığa eriştiğinde (50-55 ˚C) çeker ocak altında 2 μl etidyum bromür ilave ederiz (bu işlemde solüsyonda hava kabarcığı kalmamasına dikkat ediyoruz).

          4-) Bu işlem sonrasında hazırlamış olduğumuz solüsyonu kenarları kapatılmış jel tablasına dökeriz ( dökme işlemi yapılırken sızıntı olmamasına dikkat edilerek bu işlem yapılmalıdır).

          5-) Jel döküldükten sonra üzerinde DNA  bromfenol blue karışımı ve markerımızı  ekleyecek olduğumuz kuyucukların oluşması için jel üzerine tarağı yerleştiriz.

          6-) Jel donduktan sonra tarağı dikkatlice( jele doğrudan dokunmadan hatta bir eldiven vasıtasıyla, [doğrudan etüdyum bromür temasından kaçınmak için]) çıkararak jeli elekroforez tankına yerleştiririz. Ve tankın üzerindeki sınır çizgisine kadar TAE tamponu dökeriz.

          7-) Bir önceki deneyde izole ettiğimiz ve TE tamponu ile çözmüş olduğumuz DNA örneği ile loading buffer’ı karıştırız ve jelde tarak uçları ile oluşturmuş olduğumuz kuyucuklara boşaltırız.( Bu deneyde maker harici hazırlayacağımız DNA örneği miktarları aşağıda bulunmakta)

                     a) 2 μl DNA örneği  + 5 μl Proteaz + 3 μl distile su + bromfenol mavisi (1.ve 2. gruplar) (1. grup 3 DNA örneği, 2. grup olarak 2 tane DNA içeren örnek hazırladık[fakat el alışkanlığı içinde distile su ve bromfenol mavisi karıştırarak yükleme yapıldı)

                     b) 2 μl DNA örneği + 4 μl DNaz + 4 μl distile su + bromfenol mavisi (3. ve 4. gruplar)

          8-) Aktarma işleminden sonra cm’ye 6 V olacak şekilde akım veririz (60 V).

          9-) 30 dakika sonra DNA’nın  yürümesi işleminden sonra jeli dikkatlice (etüdyum bromür ilavesinden dolayı) alarak transüliminatör üzerine alarak UV ışığı altında fragmentlerinin analizini yapabilecek duruma geliriz.

       GÖZLEM VE SONUÇLAR :

          Bütün deneyi 1.ve 2. grup olarak agaroz jeli oluşturma aşaması da dahil olmak üzere(bu kısım daha önceki DNA analizi deneyinde hocalarımız tarafından yapılmıştı) bütün deney aşamalarını gerçekleştirdikten sonra UV ışığı altında proteaz’ın DNA üzerinde hiçbir etkisinin olmadığını gördük bunun yanında 3.ve 4. grupların DNA’ya DNaz etkisini ise ortamda hiçbir DNA fragmetinin kalmadığını görmüş olduk.

       YORUM :

          Eğer ki elimizde analizini yapacağımız bir DNA, RNA yada protein varda ve bunların tam olarak saf olmadığını düşündüğümüz zamanlarda değişik kimyasal madde içerikleriyle bunları saflaştırmak mümkün hale gelir. Örneğin bir DNA analizi sırasında ortamda protein varlığı söz konusuysa burada Proteaz kullanarak bunu ortamdan atmak ve DNA mızı saflaştırmak olası hale gelir(her ne kadar RNA uzaklaştırma deneyi yapmasak da DNA ve proteinlerin ortamdan uzaklaştırılabildiğini görünce RNA içinde bir yöntem olacağını düşünüyorum). Bu yolla sadece üzerinde çalışmak isteğimiz grupları oluşturmak ve o gruplardan istediğimiz verileri almak daha kolaylaşacaktır. Şöyleki analiz süresince (özellikle elekroforez sırasında) elimizdeki örnekte sadece istediğimiz materyal haricinde farklı bir materyal bulunması ve bunun varlığında elektroforez süresinin de etkileneceğini düşünüyorum. Yani yürütme işlemi sırasında ortamda bulunan fazla maddelerden kaynaklı(proteinleri incelerken DNA varlığı gibi olaylardan bahsediyorum) süre uzaması olayının jel açıklarından geçen maddelerin fazlalığından kaynaklı olabileceği ihtimali göz önüne geliyor. İşte bu sebeplerden dolayı incelemek istediğimiz grupların bazı kimyasallar yardımı ile sadece DNA ,RNA yada protein inceleyebilmek mümkün hale gelmektedir demek mümkün hale gelmektedir..  

Yorum bağlantısı

Yorum yazmak için hesap oluşturmalı veya giriş yapmalısın.

Yorum yapmak için üye olmanız gerekiyor

Hesap oluştur

Hesap oluşturmak ve bize katılmak çok kolay.

Hesap Oluştur

Giriş yap

Zaten bir hesabınız var mı? Buradan giriş yapın.

Giriş Yap

Hakkımızda

Biyoloji Günlüğü ülkemizdeki biyoloji öğrencileri, mezunları ve çalışanları adına kar gütmeyen bir proje olarak 9 senedir faaliyetlerine yılmadan devam etmeye çalışan masum bir projedir. Lütfen art niyetinizi forumdan uzak tutunuz. Bize iletişim formu aracılığıyla ulaşabilirsiniz.

Dilerseniz biyolojigunlugu@gmail.com veya admin@biyolojigunlugu.com adresine mail de gönderebilirsiniz. Bizimle arşivinizi paylaşmak isterseniz wetransfer.com üzerinden biyolojigunlugu.com adresine dosya transferi olarak iletmeniz yeterlidir, sizin adınıza paylaşılacaktır.

Sitemiz bir "Günlük" olarak derleme yayın, yorum, diyalog ve yazılara vermektedir. Güncel biyoloji haberleri ve gelişmelere ek olarak özellikle sosyal medyada gözden kaçan, değerli gördüğümüz tüm içeriğe kaynak ve atıflar dahilinde sitemizde yer vermekteyiz. Bu sitede verilen bilgilerin kullanım sorumluluğu tümüyle kullanıcıya aittir. Sayfalarımızda yer alan her türlü bilgi, görsel ve doküman sadece bilgilendirmek amacıyla verilmiştir.

Biyoloji Günlüğü internet sitesi 5651 Sayılı Kanun’un 2. maddesinin 1. fıkrasının m) bendi ile aynı kanunun 5. maddesi kapsamında Yer Sağlayıcı olarak faaliyet göstermektedir. İçerikler, ön onay olmaksızın tamamen kullanıcılar tarafından oluşturulmaktadır. Yer Sağlayıcı olarak, kullanıcılar tarafından oluşturulan içeriği ya da hukuka aykırı paylaşımı kontrol etmekle ya da araştırmakla yükümlü değildir.

Yer Sağladığı içeriğin 5651 Sayılı Kanun’un 8 ila 9. maddelerine aykırı şekilde; kişilik haklarınızı ihlal ettiğini ya da hukuka aykırı olduğunu düşünüyorsanız mail adreslerimizden iletişime geçerek bildirebilirsiniz. 

Bildirimleriniz dikkatle ve özenle incelenmekte olup kişilik haklarınızın ihlali ya da hukuka aykırılığın tespiti halinde mevzuat kapsamında en kısa sürede işlem yaparak bilgi vereceğiz.

×
×
  • Yeni Oluştur...

Önemli Bilgilendirme

Kullanım Şartları, Gizlilik Politikası, Forum Kuralları sayfalarına göz atınız.