Jump to content
  • Kaydol
Biyolokum

Bitki Hücrelerinden DNA İzolasyonu CTAB Yöntemi

Önerilen İletiler

Bitki Hücrelerinden DNA İzolasyonu (CTAB Yöntemi)

Bitkilerden DNA izolasyonu bitki türüne, kullanılan kısmına, materyalin kuru veya taze olmasına göre çeşitlilik gösterir. Bitkisel dokulardan DNA izolasyonunda en önemli adım hücre duvarının mekanik (ezme, dondurup kırma gibi) veya kimyasal (hücre duvarının selülaz ile sindirilmesi gibi) yöntemlerle parçalanmasıdır. DNA’ya zarar vermeyen fiziksel yöntemlerden sıvı nitrojenle dondurup kırma yöntemi sıklıkla kullanılır. Bu laboratuarda soğan hücrelerinden DNA izole edeceksiniz.

Materyaller

  • CTAB tamponu, absolüt etanol , %70 Etanol, 3M sodyum asetat, 55°C su banyosu,
  • Kloroform izoamil alkol (24:1)
  • CTAB Tamponu
  • 2 g CTAB (Hekzadesil trimetil amonyum bromit)
  • 10 ml 1M Tris pH8
  • 4 ml 0.5 M EDTA pH 8
  • 28 ml 5 M NaCl
  • 40 ml dH2O
  • 1 g PVP 40 (polivinyl pyrrolidone)
  • pH 5’e ayarlanır, son hacim distile su ile 100 ml’ ye tamamlanır.

Metot

1. Soğan köklerini parçalayarak eziniz (gerekirse hücre duvarını parçalamak için kökler -80°C’de bekleterek ya da sıvı nitrojenle dondurup kırılabilir) ve tampon içerisinde homojenize ediniz.

2. 500 μl CTAB tamponu/bitki ekstraktı karışımını bir ependorf tüpe alınız ve 15 dakika 55 °C su banyosunda karıştırarak inkübe ediniz.

3. İnkübasyondan sonra CTAB tamponu/bitki ekstraktı karışımını 1200g’ de 5 dakika santrifüj ederek hücre parçalarını çöktürünüz. DNA süpernatana çıkacaktır. Süpernatanı alıp başka bir tüpe aktarınız.

4. Tüpe 250 μl kloroform:izoamil alkol (24:1) ekleyerek karıştırınız. 1300 rpm’ de 2 dakika santrifüj ediniz. Süpernatanı alıp başka bir tüpe aktarınız. 

5. 1/10 hacim 3M sodyum asetat ve 2 hacim soğuk absolüt etanol ekleyerek (bu aşamada -20 °C’ de 1 saat bekletebilirsiniz) DNA yumağını elde ediniz. Bir pipet ucu yardımıyla DNA’ yı %70’ lik soğuk etanol içerisine alıp çevirerek karıştırınız. Bu işlemi tekrarlayınız.

Alternatif olarak 1300 rpm’ de 5 dakika santrifüj edip DNA peletini elde edebilir, üst fazı uzaklaştırdık tan sonra %70’ lik soğuk etanol ile iki kez yıkayabilirsiniz.

6. 1300 rpm’ de 5 dakika santrifüj ederek DNA peletini elde ediniz. Bütün süpernatanın uzaklaşmasını sağlayarak, DNA peletini yaklaşık 15 dakika kurumaya bırakınız. 

7. DNA peletini steril distile su veya 1x TE içerisinde çözünüz. Gerekirse 10 μg/ml RNaz A ekleyip suspense ediniz.

8. Solüsyonu DNazların inhibisyonu için 65 °C’ de 20 dakika inkübe ediniz.

İletiyi paylaş


İletiye bağlantı
Misafir
Misafir olarak yorum yapıyorsun, buradan giriş yaparak yorum yapabilirsin.
Bu konuyu yanıtla

×   Yapıştırdığınız içerik biçimlendirme içeriyor.   Biçimlendirmeyi Temizle

  Only 75 emoji are allowed.

×   Adresiniz otomatik olarak yerleştirildi.   Display as a link instead

×   Önceki içeriğiniz geri yüklendi.   Editör içeriğini temizle

×   You cannot paste images directly. Upload or insert images from URL.


Hakkımızda

Biyoloji Günlüğü ülkemizdeki biyoloji öğrencileri, mezunları ve çalışanları adına kar gütmeyen bir proje olarak 6 senedir faaliyetlerine yılmadan devam etmeye çalışan masum bir projedir. Lütfen art niyetinizi forumdan uzak tutunuz. Bize iletişim formu aracılığıyla ulaşabilirsiniz.

Dilerseniz biyolojigunlugu@gmail.com veya admin@biyolojigunlugu.com adresine mail de gönderebilirsiniz. Bizimle arşivinizi paylaşmak isterseniz wetransfer.com üzerinden biyolojigunlugu.com adresine dosya transferi olarak iletmeniz yeterlidir, sizin adınıza paylaşılacaktır.

×

Önemli Bilgilendirme

Kullanım Şartları, Gizlilik Politikası, Forum Kuralları sayfalarına göz atınız.