Bitki Hücrelerinden DNA İzolasyonu CTAB Yöntemi

Bitki Hücrelerinden DNA İzolasyonu
(CTAB Yöntemi)
Giriş
Bitkilerden DNA izolasyonu bitki türüne, kullanılan kısmına, materyalin kuru veya
taze olmasına göre çeşitlilik gösterir. Bitkisel dokulardan DNA izolasyonunda en önemli adım
hücre duvarının mekanik (ezme, dondurup kırma gibi) veya kimyasal (hücre duvarının selülaz
ile sindirilmesi gibi) yöntemlerle parçalanmasıdır. DNA’ya zarar vermeyen fiziksel
yöntemlerden sıvı nitrojenle dondurup kırma yöntemi sıklıkla kullanılır. Bu laboratuarda
soğan hücrelerinden DNA izole edeceksiniz.
Materyaller
CTAB tamponu, absolüt etanol , %70 Etanol, 3M sodyum asetat, 55°C su banyosu,
Kloroform izoamil alkol (24:1)
CTAB Tamponu
2 g CTAB (Hekzadesil trimetil amonyum bromit)
10 ml 1M Tris pH8
4 ml 0.5 M EDTA pH 8
28 ml 5 M NaCl
40 ml dH2O
1 g PVP 40 (polivinyl pyrrolidone)
pH 5’e ayarlanır, son hacim distile su ile 100 ml’ ye tamamlanır.
Metot
1. Soğan köklerini parçalayarak eziniz (gerekirse hücre duvarını parçalamak için
kökler -80°C’de bekleterek ya da sıvı nitrojenle dondurup kırılabilir) ve tampon içerisinde
homojenize ediniz.
2. 500 μl CTAB tamponu/bitki ekstraktı karışımını bir ependorf tüpe alınız ve 15
dakika 55 °C su banyosunda karıştırarak inkübe ediniz.
3. İnkübasyondan sonra CTAB tamponu/bitki ekstraktı karışımını 1200g’ de 5 dakika
santrifüj ederek hücre parçalarını çöktürünüz. DNA süpernatana çıkacaktır. Süpernatanı alıp
başka bir tüpe aktarınız.
4. Tüpe 250 μl kloroform:izoamil alkol (24:1) ekleyerek karıştırınız. 1300 rpm’ de 2
dakika santrifüj ediniz. Süpernatanı alıp başka bir tüpe aktarınız.
5. 1/10 hacim 3M sodyum asetat ve 2 hacim soğuk absolüt etanol ekleyerek (bu
aşamada -20 °C’ de 1 saat bekletebilirsiniz) DNA yumağını elde ediniz. Bir pipet ucu
yardımıyla DNA’ yı %70’ lik soğuk etanol içerisine alıp çevirerek karıştırınız. Bu işlemi
tekrarlayınız.
Alternatif olarak 1300 rpm’ de 5 dakika santrifüj edip DNA peletini elde edebilir,
üst fazı uzaklaştırdık tan sonra %70’ lik soğuk etanol ile iki kez yıkayabilirsiniz.
6. 1300 rpm’ de 5 dakika santrifüj ederek DNA peletini elde ediniz. Bütün
süpernatanın uzaklaşmasını sağlayarak, DNA peletini yaklaşık 15 dakika kurumaya bırakınız.
7. DNA peletini steril distile su veya 1x TE içerisinde çözünüz. Gerekirse 10 μg/ml
RNaz A ekleyip suspense ediniz.
8. Solüsyonu DNazların inhibisyonu için 65 °C’ de 20 dakika inkübe ediniz.

Paylaşıma Oy Ver

0 puan

Total votes: 0

Upvotes: 0

Upvotes percentage: 0.000000%

Downvotes: 0

Downvotes percentage: 0.000000%

Cenk Önsoy

Cenk Önsoy

Biyoloji okumadan, görmeden, yaşamadan öğrenilecek bir bilim dalı değildir.

3 Yorum

Yorum yap

Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir